Protocolo de fermentación para producción de Koji

Objetivo

Este protocolo tiene como objetivo estandarizar el proceso de producción de Koji a través de la definición y descripción de:

  • los materiales utilizados para su producción
  • las diferentes fases del proceso
  • los parámetros implicados durante el proceso
  • las correlaciones entre los parámetros del proceso y la producción enzimática
  • análisis de tipo teórico sobre los riesgos toxicológicos del proceso.

Se busca optimizar el proceso considerando el crecimiento del hongo, con el fin de obtener el máximo crecimiento de micelio, la máxima producción enzimática, evitar la contaminación bacteriana durante el cultivo del hongo y en los materiales empleados y  prevenir la inactivación de las enzimas producidas.

Introducción

El koji es un ingrediente muy importante en la tradición alimentaria en el sudeste asiático y en asia oriental, constituye el primer paso en la producción de alimentos fermentados como la salsa de soja, el miso, el mirin, el sake o el amazaké.  Su  producción se basa en la inoculación de un substrato de granos (ricos en carbohidratos y proteínas) con Aspergillus oryzae, el cual realiza un proceso fermentativo con la consecuente producción de enzimas  extracelulares (amilasas y proteasas) que tienen la capacidad de hidrolizar macromoléculas  como el almidón, dextrinas y proteínas, convirtiéndolas en carbohidratos más simples, péptidos o aminoácidos. La producción enzimática es una característica fundamental del proceso y es la actividad de estas enzimas sobre diversos substratos, lo que convierte al Aspergillus oryzae en la primera etapa de múltiples elaboraciones y fermentaciones.

Agente

El microorganismo responsable de la fermentación en el  proceso de producción de Koji  es  el Aspergillus oryzae, es un hongo filamentoso con  la capacidad de excretar, en grandes cantidades, diferentes enzimas  hidrolíticas. La capacidad de secretar proteínas al medio, se potencia si el cultivo se realiza en un medio sólido comparado con un medio sumergido (Biesebeke et al. 2002). Los dos principales metabolitos primarios secretados por el Aspergillus Oryrzae son la α-amilasas (endo-1,4- α -d-glucanglucohydrolase EC 3.2.1.1) y las proteasas (Chancharoonpong et al. 2012).

La α-amilasa realiza una hidrólisis random de los enlaces  α-1,4 en la cadena lineal de las macromoléculas de almidón. De su acción se obtienen dextrinas y cadenas cortas constituidas por glucosa. De este modo la amilasas encuentra particulares aplicaciones en la industria de alimentos, textil y en la industria del papel.

En relación a las proteasas, estas son clasificadas en función de su acidez en ácidas, neutras y alcalinas según el pH en cual tienen la máxima actividad. Las proteasas neutras son unas de las más importantes en la industria de alimentos ya que tienen la capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos a pH neutro reduciendo la amargura (Sandhya C. et al. 2005). Las proteasas ácidas están presentes en la mayor parte de aplicaciones del koji donde el pH es ácido.

Medio de cultivo

El medio de cultivo  puede ser  constituido por diferentes cereales (trigo, arroz, cebada, ect) los cuales presentan una composición de macromoléculas bastante similar Tabla 1.  La fermentación en cuestión se realiza en un medio sólido. Este tipo de medio es muy beneficioso para el crecimiento del hongo debido al bajo contenido de agua (40-60%), permitiendo la penetración de los micelios del hongo a través del substrato sólido. Por otra parte, la baja humedad en un medio de cultivo sólido,  hace que  los microorganismos adquieran la capacidad de producir metabolitos (deseados en el caso de la producción de Koji), que en medio líquido no serían  producidos. (Biesebeke et al. 2002).

Al considerar diferentes cereales como substrato, no hay diferencias significativas respecto a la producción enzimática. Sin embargo, el substrato de trigo permite  la máxima producción, a nivel de expresión génica, de enzimas hidrolíticas específicamente α-amilasas (Maeda et al., 2004). Como evidencian los estudios de (Machida et al., 2008) el A. oryzae en un terreno de cultura sólido constituido por trigo es capaz de producir cerca de  50 g de α-amilasas por kilo de trigo.  Otros terreno de cultivo  a base del arroz favorecen la producción de proteasa (Chutmanop et al., 2008).

Trigo
Proteína 15%
Grasa 6%
Carbohidratos 79%
Cebada
Proteína 13%
Grasa 6%
Carbohidratos 81%
Arroz
Proteína 8%
Grasa 4%
Carbohidratos 88%

Tabla 1. Datos del trigo. Fuente: Bedca  (Base de Datos Española de composición alimentaría)

Parámetros

Los parámetros fundamentales durante los procesos de fermentación son:

  • Humedad del substrato
  • Temperatura
  • Tiempo

Entre los parámetros antes mencionados no se encuentra el pH, ya que dicho parámetro en la producción de Koji no resulta un parámetro crítico  en la producción enzimática (amilasas y proteasas), si el intervalo de trabajo  es cercano a la neutralidad (pH 5,5- 7,5) como lo indica (Francis et al., 2003) y (Sandhya et al., 2005).

Por su parte la concentración de Aspergillus en el medio se fija a 10 esporas/g DS en el medio.

Es necesario mencionar que las condiciones óptimas de crecimiento del hongo, no corresponden  con las condiciones óptimas de producción enzimática. Por este motivo  para definir las condiciones se tienen  que considerar tres protagonistas en la producción del koji: el Aspergillus oryzae, α-smilasas y proteasas (neutras y ácidas). Las condiciones de producción óptimas resultan las condiciones en las cuales se permite el crecimiento del microorganismo y maximizan la producción de los metabolitos primarios de interés.

Otro aspecto importante radica en el hecho de que las amilasas y la proteasas son producidas en fases diferentes  del crecimiento del microorganismo. Por una parte, las amilasas son excretadas  al inicio del proceso metabólico (0-18h) puesto que son enzimas necesarias que permiten la disponibilidad de alimento (carbohidratos simples) para el  microorganismo (Chutmanop et al., 2008). Las proteasas, por su parte, son producidas en una segunda fase (18-48h) cuando el microorganismo ya ha crecido suficientemente y ha consumido los carbohidratos disponibles en el medio de cultivo (Chutmanop et al., 2008).

Humedad inicial

En los procesos fermentativos en estado  sólido, la humedad inicial del substrato es un factor crítico en el crecimiento del hongo y en la producción  enzimática. La presencia de agua en el sustrato hace que los nutrientes sean más  accesibles para el hongo, favoreciendo su crecimiento. Un exceso de la humedad del sustrato  afecta a la difusión del oxígeno en el medio reduciendo la porosidad, haciendo que las partículas se peguen entre si afectando negativamente a la transferencia de oxígeno al  hongo, y por consiguiente al crecimiento del microorganismo. Por otra parte, una disminución de la porosidad impide la disipación de calor, favoreciendo  un incremento de la temperatura durante la primera fase en donde hay una respiración muy activa. Una temperatura elevada (superior a 45ºC) puede matar el microorganismo.

Por su parte una baja humedad del sustrato reduce los valores de agua libre hasta niveles que no favorecen el  crecimiento del hongo.

Durante el proceso fermentativo, en especial durante la fase de crecimiento del microorganismo, se evidencia una actividad respiratoria del mismo elevada con consecuente  producción de CO2 y agua,  que se traduce en un aumento de humedad. Sin embargo después de esta primera fase de crecimiento el metabolismo de hongo disminuye su cinética y se presenta una reducción en la humedad de medio (Chancharoonpong et al. 2012).

Las condiciones óptimas de humedad para crecimiento del hongo, no  corresponden  con las condiciones óptimas de producción enzimática (Tablas 2).

Estado Humedad % subtrato
Crecimiento Aspergillus oryzae 40 a
Producción α-amilasas 70 a
Producción proteasas neutras 35 c

Tablas 2. Condiciones de Humedad óptima del sustrato para el crecimiento del Aspergillus oryzae, α-amilasas y proteasas neutras.  Fuente: a. Narahara et al, 198 , b.  Francis et al., 2003, c. Narahara et al, 1982

La humedad  inicial óptima  del medio de cultivo es 50-55%.  Esta humedad favorece el crecimiento del microorganismo y la producción de amilasa en las primeras horas de proceso. Considerando la disminución de la humedad durante la segunda fase metabólica, la humedad del medio resulta muy cercana a la humedad óptima para la producción de proteasas.

Figura 2: perfil del pH y de la humedad en el tiempo: Fuente (Chancharoonpong et al. 2012)

Temperatura

La temperatura resulta un parámetro fundamental en el desarrollo de los parámetros biológicos, ya que determina los efectos de la desnaturalización de las proteínas, la inhibición enzimática, y  la activación o supresión de la producción de metabolitos.

Al igual que con la humedad del medio de cultivo, la temperatura óptima de crecimiento del Aspergillus oryzae, difiere de la temperatura óptima de producción de  α-amilasas y proteasas (tabla 3)

Estado T Optima ºC
Crecimiento Aspergillus oryzae 38 a
Producción α-Amilasas 30-35  b
Producción Prótesis 25-30 c, d

Tablas 3. Condiciones de temperatura óptima del sustrato para el crecimiento del Aspergillus oryzae, α-amilasas y proteasas neutras.  Fuente a.  Narahara, H. et al, 198 , b.  Francis. et al., 2003, c.  Chutmanop et al., 2008, d. Narahara. et al, 1982

Por este motivo durante el proceso de producción de Koji es oportuno utilizar dos temperaturas a lo largo del proceso. Una temperatura en la fase inicial (0-18h)  de 32ºC, para favorecer el crecimiento del Aspergillus y la producción de amilasas y  otra temperatura en la fase de producción de proteasas (18-48h) de entre 25-30ºC.

El parámetro de la temperatura puede verse afectado si no tenemos en cuenta que durante la primera fase  de este proceso (0-18 h), como consecuencia de la actividad metabólica (respiración con consecuente liberación de energía térmica) se produce un aumento de la temperatura.

Por lo tanto sería oportuno durante la primera fase,  fijar el SP (set point) de temperatura en 32ºC. Esta temperatura aumentará  6ºC por el calor emitido por la actividad metabólica y por consiguiente se trabajara en un rango de temperatura de entre 32ºC y 38ºC, rango óptimo para el crecimiento microbiológico y para la producción de amilasas.

Tiempo

La producción de koji debe tener un tiempo máximo de 48 h, ya que la máxima producción de proteasas se alcanza después de 48h, acto seguido entra en una fase decreciente (Chancharoonpong  et al. 2012).

Por otra parte después de 50 h el Aspergillus oryzae, inicia la producción de metabolitos secundarios entre los que se encuentran el ácido Kojico, ácido ciclopiazónico, Maltorizina, ácido 3-Nitropropiónico, los cuales son tóxicos (Blumenthal, 200).

a)

b)

Figura 4. a) Temperatura y humedad de Set point (SP) en la producción de Koji. En términos de humedad del medio solo se considera la humedad inicial del medio a 55%.   Considerando la temperatura se establecen dos SP de temperatura  en función del tiempo.  Tiempo 0-18h de Temperatura SP= 32ºC y tiempo de 18-48h de   Temperatura SP=25ºC. b) Tendencia de la actividad enzimática de las proteasa y amilasa en función del tiempo. Fuente: Chutmanop  et al., 2008.

Figura 5. Descripción de las condiciones  tiempo y temperatura de crecimiento óptimo de Aspergillus oryzae y  producción de α-amilasas y proteasas. 

Materiales y Método

Materiales:
  • 1kg de Cereal (cebada, trigo o arroz).
  • 2 g Esporas de Aspergillus oryzae.
  • Horno o estufa con control de temperatura y conservador de humedad.
  • Paños limpios esterilizados
  • Recipiente rectangular plástico.
  • Termómetro.
  • Alcohol para desinfección de los materiales y equipos.
  • Guantes propileno
Método tradicional de la preparación del  Koji:

La preparación del Koji sigue las siguientes fases:

  • Remojo
  • Cocción (vapor)
  • Enfriamiento
  • Inoculación
  • Incubación

Los pasos de preparación se describen a continuación:

1. Remojar el cereal durante 12 h mínimo. Para el remojo se utiliza agua para favorecer que el grano se ablande.

2. Cocinar el cereal en un horno a vapor  100ºC durante 90 minutos utilizando una bandeja perforada filmada.

3. Una vez el cereal se ha enfriado (35-30ºC), esterilizar las manos con alcohol, ponerse guantes y verter el cereal en un contenedor hermético creando un estrato de aproximadamente 2 cm de espesor.

4. Preparar un paño, esterilizado caliente, húmedo y escurrido para cubrir el koji.

5. Cuando el salvado ha llegado a una temperatura de 35ºC y se ha dispuesto el cereal en una bandeja con las esporas de A. oryzae en polvo y se mezcla bien en modo de cubrir todos los granos.  A continuación se cubre el todo con el paño antes preparado.

6. Poner en una bandeja en la incubadora con control de temperatura a  32ºC. Consideraremos ahora tiempo 0 en la fermentación.

7.  Después de 18h (t=18h), se retira la bandeja y se mezcla  el koji para airear y asegurar una distribución uniforme de las esporas. Debe comenzar a oler afrutado y fragante.  Rehumedecer el paño, cubrir nuevamente. Cambiar el set point de la temperatura del horno a 25ºC. A este punto se introduce el recipiente en la incubadora nuevamente.

8. Al t=24h mover nuevamente el koji. Volver a introducir el recipiente ala incubadora con el paño humedecido.

9. Al t =30h, se mezcla  por la última vez el koji, Se humedece de nuevo el paño  y se introduce el recipiente en la incubadora.

10.  Después de 36h el micelio ha cubierto completamente  los granos  y se encuentra completamente mezclado con el substrato. En  este periodo se evidencia la producción de proteasas.

11. A las 48 h retirar el koji de la incubadora.

Evaluación Toxicológica

Durante la fermentación Aspergillus oryzae además de la producción de amilasas y proteasas,  se producen metabolitos secundarios muchos de los cuales pueden ser tóxicos: ácido kojico, ácido ciclopiazónico, maltorizina, ácido 3-Nitropropiónico entre otros. Sin embargo, como es declarado por Environmental Protection Agency (EPA), 1997b en su documento de decisión final,  bajo las condiciones usuales de cultivo, la cepas comercializadas de Aspergillus oryzae no parecen  producir micotoxinas  a niveles significativos. Esta afirmación es  confirmada por diferentes estudios científicos (Kusumoto, K. I.et al., 1998; Kusumoto, K. I.et al., 2000; Liu and Chu, 1998; Watson et al., 1999; Wei and Jong, 1986) en donde se afirma que los genes del A. oryzae responsables de la biosíntesis de aflatoxinas estas desactivados.

Por otra parte, la producción de ácido ciclopiazónico no se verifica con  tiempos de inoculación de A. oryzae inferiores a 50h como lo evidencia Goto et al. 1987. El  tiempo de inoculación descrita en este método, es  de 48 h por lo tanto,  se puede concluir que no habrá producción de este metabolito.

Por su parte, la producción de maltorizina depende de la composición del substrato y en el caso de producción de koji utilizando arroz, cebada,  trigo o maíz, no se verifica la producción de este compuesto (Blumenthal, 2004).

En cuanto al ácido kojico, fue demostrado por  Burdock et al, 2001 que no presenta un peligro para la salud humana en las concentraciones producidas durante la fermentación producida por Aspergillus oryzae.

Conclusiones

La producción de koji es un proceso fermentativo, a partir del crecimiento de Aspergillus oryzae en un substrato sólido, formado por cereales ricos en carbohidratos y proteínas, que tiene como objetivo  la producción de amilasas y proteasas.  Teniendo en cuentas que estos dos tipos de enzimas son secretadas en fases diferentes del proceso, se proponen finalmente  los siguientes parámetros para maximizar la producción de las dos enzimas: humedad inicial del medio 50-55 %; temperatura en las primeras 18h de proceso de 32ºC y temperatura en la segunda fase del proceso (18h-48h) de 25ºC; un tiempo de crecimiento máximo de 48h.

Se concluye  que el proceso de producción de Koji,  siguiendo las indicaciones presentadas en este estudio,  no  conlleva  la producción de sustancias tóxicas como aflatoxinas y otros metabolitos secundarios tóxicos.

Bibliografia

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